9-1. 伝統的なサブクローニング

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1) サブクローニングとは

一度クローン化されたDNA断片を目的のベクターに挿入し直し、新たな組換えDNAを構築した跡でそれを細胞に導入し、そこで増やす操作をサブクローニングという

操作はDNA断片を得ることから始まるが、このためには制限酵素によるDNAの切断が必須であり、必要に応じて目的断片をゲル電気泳動で分離・抽出する

PCRで増幅したDNAを用いてDNA調製のステップを単純化する方法もよくとられる

2) DNAリガーゼによるベクターとDNA断片の連結

粘着末端同士での連結

伝統的サブクローニングでは、付着させたDNAをDNAリガーゼで連結する操作が必要

DNAリガーゼによるDNAリガーゼによる末端の連結は5'-リン酸基と3'-OHとの組み合わせで進む

5'末端にリン酸基が付いていない場合はポリヌクレオチドキナーゼでリン酸基をつける

逆に連結させたくない場合はホスファターゼでリン酸機を除く

上記以外の末端同士の連結

異なる形状のDNA末端同士を連結させるには、末端をいったん平滑化(末端修復ともいう)し、その後4章で述べた方法によってDNAを連結する

平滑末端同士の強引な結合、あるいはリンカーを使った結合や、制限酵素認識部位をリンカーとするPCRでDNA断片を合成し直すという方法が一般的

制限酵素認識部位がなかったり、操作が何重にも組み合わさって煩雑になる場合は、次節のDNAリガーゼを使わない方法も選択肢と成る